La infección por Orf no es de carácter sistémico y por lo tanto, la presencia de virus detectable en los periodos asintomáticos es nula; sin embargo, la respuesta inmune es duradera y consiste, entre otros procesos, en la producción de anticuerpos. La detección de anticuerpos en animales infectados asintomáticos, mediante métodos automatizados como el ELISA, podría ser de gran utilidad en futuros programas de control encaminados a reducir el impacto económico y mejorar el bienestar animal de los ovinos y caprinos, no sólo de Navarra, sino en toda Europa.
Objetivos.- Este proyecto colaborativo pretende desarrollar herramientas diagnósticas para el control del EC. Para ello, se estableció una colaboración entre el grupo coordinador (CSIC) y el socio (INTIA) para la obtención de muestras a partir de animales que muestren la enfermedad. Debido a la estacionalidad en la aparición de animales enfermos, las lesiones suelen aparecer en primavera y en otoño, y las fechas de ejecución del proyecto (resolución de junio de 2018), el INTIA de Navarra tan solo pudo recolectar muestras procedentes de 3 rebaños de nuestro territorio. Con el objetivo de comparar las muestras Navarras con las del entorno más cercano, se obtuvieron muestras de Aragón gracias a una colaboración con la Universidad de Zaragoza. Además, obtuvimos muestras de Mallorca, con la intención de averiguar las diferencias que podrían existir entre virus procedentes de zonas con poco intercambio de animales y geográficamente distantes.
Tras la extracción de ADN y el aislamiento de cepas virales en cultivos celulares, hemos podido aportar las primeras secuencias de virus Orf en nuestro entorno, correspondientes a cinco genes diferentes (B2L, VIR, VIL10, Orf132 y Orf109) codificantes de proteínas de superficie, con una alta probabilidad de contener epitopos inmunodominantes con los que desarrollar tests diagnósticos. Las secuencias obtenidas en Navarra muestran una gran similaridad con las obtenidas en Aragón o en Mallorca en todos los genes analizados. La secuencia depositada en bases de datos que muestra mayor similaridad con las halladas en este proyecto procede de Argentina, indicando, por un lado que los genes analizados están conservados entre estirpes distantes geográficamente y por lo tanto, son buenos candidatos a emplear como antígenos en pruebas de ELISA, y por otro, que se puede asumir que las secuencias descritas en el proyecto son representativas de la totalidad del territorio navarro.
Todas las PCRs realizadas han resultado ser de utilidad para diagnosticar la presencia de virus en todas las muestras de lesiones analizadas. Además, hemos desarrollado una PCR en tiempo real basada en el gen B2L, capaz de cuantificar las partículas virales presentes en una muestra de costra y en cultivos celulares derivados del aislamiento viral.
El aislamiento de cepas en cultivo celular se realizó en colaboración con la Universidad de Buenos Aires. Se han aislado dos cepas diferentes procedentes de animales navarros que, a través de dicha colaboración, estamos secuenciando en su totalidad.
En todos los genes se realizó la caracterización de regiones inmunodominantes a través del análisis del perfil de hidrofobicidad, antigenicidad y expresión en la superficie, identificando la proteína B2L como la más indicada (Fig. 2) para la evaluación de la respuesta de anticuerpos.
Los sueros obtenidos de los animales infectados en Navarra presentaron anticuerpos frente a proteínas de virus aislados a partir de animales navarros. Teniendo en cuenta el peso molecular de las proteínas que reaccionan podría tratarse de B2L.
Actualmente nos encontramos sintetizando y purificando antígenos recombinantes basados en las secuencias de Navarra, para la puesta a punto de una técnica ELISA que nos permita cuantificar la producción de anticuerpos y abrir la posibilidad al desarrollo de kits diagnósticos.
Conclusiones.- Este proyecto ha contribuido con herramientas moleculares al diagnóstico del EC en Navarra, permitiendo incluso la cuantificación de la carga viral mediante PCR cuantitativa. Además, hemos puesto de manifiesto la presencia de anticuerpos en el suero de animales infectados, abriendo la posibilidad al empleo de ELISA para el diagnóstico del EC en Navarra. Finalmente, el aislamiento y la caracterización genética de las primeras estirpes de nuestro entorno permitirán, a través de la divulgación científica, situar la infección por Orf en el panorama internacional.
