Un sistema inducido que permite el encendido y apagado del gen de forma regulada puede evitar el silenciamiento epigenético que ocurre en algunos casos de expresión constitutiva. A esto hay que sumar el hecho de que los vectores virales empleados en muchas ocasiones no llegan al suficiente número de células en el tejido diana y eso hace que la expresión de proteína terapéutica sea incluso más insuficiente. Por lo tanto, es necesario desarrollar sistemas regulables de muy alta expresión que nos permitan producir en las células infectadas cantidades de proteína terapéutica superiores a las que se dan de forma fisiológica para suplir la falta de expresión en el resto de las células que no han sido infectadas.
En condiciones naturales, la expresión de los genes se encuentra altamente regulada para expresarse en el momento adecuado y en las dosis justas requeridas. Una expresión descontrolada y mantenida en el tiempo, lejos de ser terapéutica, puede incluso resultar nociva. La regulación génica puede tener lugar a nivel del promotor, que es el que controla la transcripción a ARN, y también puede regularse a nivel de traducción. Dentro del propio transcrito (ARN) pueden existir regiones con secuencias concretas de regulación que determinen la localización, estabilidad y vida media del transcrito de ARN mensajero. La regulación a nivel de promotor ya existe en terapia génica gracias al uso de promotores de tejido específicos y al uso de promotores regulados por ligandos, sistemas que a su vez requieren de la expresión de una proteína reguladora. La presencia de esta proteína reguladora necesaria para disponer de un promotor inducible implica un aumento del material genético y una mayor antigenicidad. La proteína de regulación del promotor es de origen exógeno, haciendo que el sistema inmune termine reconociendo y eliminando las células que han incorporado el gen terapéutico. En este proyecto nos centramos en la regulación a nivel del ARN, lo cual simplifica la complejidad del vector y reduce la antigenicidad. Durante este año hemos desarrollado un sistema artificial de regulación génica a nivel de transcrito (ARN mensajero) que permite un encendido y apagado del gen mediado por la interacción con un ligando químico inocuo. Además, perseguimos identificar motivos de ARN en la región no codificante del gen que aumente la expresión de la proteína terapéutica.
Este proyecto se lleva a cabo gracias a la unión de dos grupos que trabajan en RNA en campos diferentes pero altamente complementarios. Por un lado, un grupo posee una alta experiencia en el estudio de los mecanismos de regulación del ARN mensajero asociado al complejo U1, habiendo sido un grupo pionero en la identificación de sistema de inhibición de la expresión génica basado en la capacidad del U1 snRNA endógeno de inhibir la poliadenilación cuando se une en el extremo 3 ́ de un ARN mensajero. El segundo grupo trabaja en el campo de los aptámeros como herramientas terapéuticas, siendo los aptámeros moléculas de ARN con estructuras globulares terciarias complejas que pueden interaccionar con su ligando con una alta afinidad en el rango nanomolar-picomolar y con exquisita especificidad, capaces de discernir moléculas con mínimos cambios conformacionales. Los aptámeros, como moléculas de ARN, pueden expresarse artificialmente en una célula; de hecho, estos aptámeros se pueden ingenierizar para que actúen como reóstatos permitiendo un cambio de estructura tras la unión con el ligando (riboswitch –interruptor de ARN). Combinar esta tecnología de aptámeros/riboswitches con motivos de unión a U1 nos permitiría modular la expresión del ARN mensajero en presencia del ligando del aptámero haciendo que este libere o enmascare el sitio de unión a U1. Ya hemos testado algunos riboswitches combinados con sitios de unión U1 con capacidad de inducir la expresión génica hasta 10 veces. Ahora estamos intentando identificar nuevos riboswitches con una mayor potencia a través de un proceso de evolución artificial. Se considera un éxito los aumentos de hasta 50% en eficacia. Pensamos que con nuestros sistemas de evolución artificial de riboswitches podríamos llegar a aumentos muy superiores.
Estos son los objetivos planteados en este proyecto:
Objetivo 1. Desarrollo de un sistema inducible para regular la expresión génica basado en RNA.
Hemos testado e identificado diferentes sistemas inducibles tipo riboswitches con capacidad de inducción entre 3-10 veces respecto a los niveles basales. Hemos realizado varios ciclos de selección evolutiva para identificar especies de riboswitches con alta tasa de inducción (>10 veces).
Objetivo 2. Desarrollo de un sistema para aumentar la expresión génica basado en RNA.
Hemos probado varias secuencias con capacidad para aumentar la expresión génica y estamos intentando neutralizar la variabilidad encontrada con secuencias menos complejas.
Objetivo 3. Analizar la combinación de los dos sistemas de regulación.
Objetivo 4. Determinar la aplicabilidad de los sistemas a la terapia génica.
Hemos probado los sistemas de inducción con riboswitches en líneas celulares con genes reporteros de actividad in vitro. Estos vectores de expresión inducibles por riboswitches se han probado también en un ensayo preliminar in vivo: empleando un método de expresión en hígado hemos confirmado que el sistema es inducible tras suministración del fármaco que regula el riboswitch; esto se ha hecho empleando unos genes reporteros de actividad que emiten luz.
